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軟骨細胞分化のSox9媒介調節に関与する因子を同定するために、軟骨細胞株ATDC5（10）から生成したcDNAライブラリーを、Col2a1遺伝子プロモーターを用いてルシフェラーゼレポーターアッセイを行うことによりスクリーニングした. これらのうちの1つは、2つのRNA認識モチーフ（RRM）を含み、核の副甲状腺体に局在する全長p54nrbタンパク質（11 13）をコードする（14）. 本発明者らは、p54nrb mRNAがATDC5細胞および初代マウス軟骨細胞において発現されることを確認した（データ示さず）. p54nrbとSox9との間の機能的関係を調べるために、我々は、Sox9の転写活性に対するp54nrbの効果を決定した. p54nrbの過剰発現は、Col2a1遺伝子プロモーターのSox9トランス活性化を著しく増強した（図1B）. 我々は、Sox9が発現していないHeLa細胞において、p54nrbによるCol2a1プロモーター活性のアップレギュレーションを観察しなかった（図1C）. 対照的に、p54nrbは、骨芽細胞分化の必須転写因子であるRunx2の転写活性に影響を与えなかった（図1D）。これは、p54nrbがSox9の転写活性を特異的に刺激することを示唆している. p54nrbとSox9との間の機能的協調の基礎を調べるために、本発明者らは、p54nrbタンパク質とSox9タンパク質が相互作用するかどうかを試験した. 図1Eに示すように、共免疫沈降実験は、p54nrbとSox9との間の物理的関連を示した. これらの結果は、p54nrbがSox9の転写パートナーとして機能することを示している.

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次に、我々は、p54nrbとSox9との間の機能的相互作用がCol2a1遺伝子プロモーター活性の調節に必要であるかどうかを決定しようと試みた. p54nrbへの結合活性を欠くドミナントネガティブSox9突然変異体の過剰発現は、p54nrbによるCol2a1プロモーター活性の刺激を著しく阻害した（図2、AおよびB）. Sox9（図2、CおよびD）に対する結合活性を欠くp54nrb、Mの変異体は、Sox9の転写活性を刺激しなかった（図2E）. さらに、p54nrb（図2、FおよびG）のノックダウンは、Col2a1遺伝子プロモーター上のSox9の転写活性を明らかに阻害した（図2H）. これらの結果は、p54nrbがSox9の重要な転写パートナーであり、このパートナーシップがCol2a1遺伝子プロモーター活性をアップレギュレートすることを示した. （A）ATDC5から単離したcDNAクローンによるCol2a1プロモーター活性の刺激. ATDC5細胞をCol2a1-ルシフェラーゼ構築物とともに各cDNAでトランスフェクトし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した. （B）Col2a1プロモーター活性に対するp54nrbおよびSox9の共刺激効果. ATDC5細胞にSox9と共にp54nrbをトランスフェクトし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した. （C）HeLa細胞におけるp54nrbによるCol2a1プロモーター活性のアップレギュレーションがない. HeLa細胞にSox9と共にp54nrbをトランスフェクトし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した. オステオカルシン遺伝子プロモータールシフェラーゼ構築物を、示したプラスミドを用いてC3H10T1 / 2細胞にトランスフェクトした. Myc-p54nrb、HA-Sox9、またはその両方を発現する細胞溶解物を、抗HA抗体によるイムノブロッティング、続いて抗Myc抗体による免疫沈降によって決定した. 図2 Col2a1遺伝子プロモーター活性のアップレギュレーションにおけるp54nrbとSox9の会合の重要性. （A）ドミナントネガティブSox9（DN）によるp54nrb刺激Col2a1プロモーター活性の阻害.

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Col2a1ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクトしたATDC5細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を、示された発現ベクターとともに測定した. 野生型を発現する細胞溶解物またはHA-Sox9の変異体をHis-tag-p54nrbタンパク質で沈殿させ（Ppt）、沈降物を抗HA抗体を用いたイムノブロッティングにより決定した. 野生型またはp54nrbの突然変異体を発現する細胞溶解物をタンデムアフィニティー精製タグ付き（TAP標識）Sox9タンパク質で沈降させ、次いで抗Myc抗体によるイムノブロッティングにより沈殿物を決定した. （E）変異体p54nrb（M）は、Sox9の転写活性をトランス活性化することができなかった. 示されるように構築物をATDC5細胞にトランスフェクトし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した. GFPまたはp54nrb（shGFPまたはshp54nrb）のshRNA発現ベクターをATDC5細胞にトランスフェクトし、RT-PCR分析によって細胞の全RNAを決定した. ATDC5細胞をshGFPまたはshp54nrbでトランスフェクトし、細胞溶解物を抗p54nrbおよびα-アクチン抗体を用いたイムノブロッティングにより調べた. （H）p54nrbのノックダウンによるSox9依存性Col2a1プロモーター活性の阻害. ルシフェラーゼ活性を、示された発現ベクターでトランスフェクトした細胞溶解物中で測定した. p54nrbは、副甲状腺核内のパラスペックルタンパク質1（PSS1）と共局在し、相互作用することが報告されている（14,16）. 核のパラスペックルはDNA複製、転写、mRNAの成熟を含む核事象に関与していると推定されているが（17）、その生物学的役割は不明である. まず、Venus標識p54nrbを用いてATDC5細胞におけるp54nrbの細胞内局在を決定した.

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p54nrbはRNAスプライシングに関与する核スペックル本体タンパク質であるSC-35（図3B）ではなく、核スペックル（図3A）内の核に限定され、PSP1（図3A）と共局在した（18,19）. 図1に示される結果と一致して、p54nrbは、トランスフェクトされた細胞および初代マウス軟骨細胞（図3、C F）においてSox9と共局在化され、. p54nrbと同様に、Sox9はPSP1と共局在したがSC-35とは共局在しなかった（図3、GおよびH）. Sox9が共過剰発現すると、副鼻腔の体の大きさはより小さくなった（図3、CおよびD）. 核スペックルの大きさは、以前に細胞の転写状態と逆相関することが示されているので（17）、我々のデータは、p54nrbとSox9との相互作用が転写活性を刺激することを示唆している. 図3 paraspeckle核内のSox9によるp54nrbのコロケーション. Venus標識p54nrb（Venus-p54nrb）およびDsRed標識PSP1（DsRed-PSP1）をトランスフェクトしたATDC5細胞を蛍光顕微鏡下でモニターした. Venus標識p54nrbでトランスフェクトしたATDC5細胞を抗SC-35抗体で免疫染色した. Venus標識p54nrbおよびDsRed標識Sox9（DsRed-Sox9）をトランスフェクトしたATDC5細胞を蛍光顕微鏡下でモニターした. Venus標識p54nrbおよびDsRed標識Sox9でトランスフェクトしたC3H10T1 / 2細胞を、共焦点顕微鏡下でモニターした. Venus-p54nrbおよびDsRed-Sox9の両方を発現するC3H10T1 / 2細胞は、Venus-p54nrb（D）のみを発現するC3H10T1 / 2細胞よりも小さなスペックルサイズを示す. マウスの肋骨から単離した初代軟骨細胞を、抗p54nrbおよび抗Sox9抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡下で撮影した. DsRed標識Sox9およびVenus標識PSP1（Venus-PSP1）をトランスフェクトしたATDC5細胞を蛍光顕微鏡下でモニターした. DsRed標識Sox9でトランスフェクトしたATDC5細胞を抗SC-35抗体で免疫染色した. p54nrbの2 RRMはポリピリミジントラクト結合タンパク質関連スプライシング因子（PSF）のRRMドメインと高度に相同であるため、p54nrbは軟骨形成に必要な標的遺伝子のスプライシングに関与していると推測した.

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本発明者らは、Col2a1遺伝子カセットを用いてミニ遺伝子アッセイを行うことにより、Col2a1 mRNAのプロセシングを調べた。これは、天然プロモーターによって駆動される選択的にスプライスされたエキソン2を含む（20）. Sox9またはp54nrbの過剰発現は、エクソン2（20,21）を含むCol2a1（IIA）のスプライス転写物を産生した（図4、AおよびB）. さらに、Sox9およびp54nrbの同時過剰発現は、Sox9またはp54nrb単独の発現よりCol2a1（IIA）の転写産物をより多く産生した（図4、AおよびB）. さらに、Sox9およびp54nrbの同時過剰発現は、分化した軟骨細胞において優先的に発現されるII型Bアイソフォーム（図4A）も産生した（21）. しかし、p54nrbはフィブロネクチン遺伝子のスプライシングに関与していない（図4C）. これらの結果は、p54nrbがCol2a1 mRNAのスプライシングおよび成熟を特異的に制御することを示唆する. このプロセスにおけるp54nrbの役割をさらに理解するために、我々は2つのRRMを欠くp54nrb（224）の突然変異体を生成した（図2C）. 突然変異体が発現されたATDC5細胞では、ATDC5細胞の増殖に影響を及ぼさず（図5B）、SC-35と共局在しない（図5C）、パラスペックル本体の形状は丸まった（図5A）. しかしながら、興味深いことに、突然変異体p54nrbはSox9の転写活性を依然としてアップレギュレートし（図5D）、Sox9への結合能力を保持した（図2D）. さらに、突然変異体p54nrbがSox9と共局在する場合、スペックルのサイズはより小さかった（図5E）. 次に、本発明者らは、Col2a1 mRNAのプロセシングにおけるp54nrb RRMおよび準核核細胞の両方の役割を評価した. 突然変異体p54nrbの過剰発現は、Col2a1 mRNAの成熟をブロックした（図5F）. 本発明者らは、突然変異体p54nrbのこの効果は、ミニ遺伝子の転写の阻害によるものではないことを確認した（図4B）. 集合的に、この結果は、p54nrbが、Col2a1 mRNAのスプライシングおよびRRMを介したパラスペックルボディの形成の両方を調節することを示す.

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Col2a1遺伝子のミニ遺伝子構築物を、ATDC5細胞に示されるような発現プラスミドでトランスフェクトした. ミニ遺伝子産物（上パネル）または - アクチン（下パネル）Ex1、エクソン1に特異的なプライマー（方法を参照）を用いたRT-PCR分析によって、細胞から単離した全RNAを決定した. （B）Col2a1 mRNAのプロセシングに対する野生型および突然変異体p54nrbの効果. Col2a1遺伝子のミニ遺伝子構築物を、ATDC5細胞に示された発現ベクターでトランスフェクションした. スプライスされたミニ遺伝子産物（上パネル）および非スプライシングミニ遺伝子産物（下パネル）の発現は、スプライシングされたミニ遺伝子産物およびスプライスされていないミニ遺伝子産物に特異的なプライマー（方法を参照）を用いたリアルタイムPCRによって決定された. HEK293細胞に、モック（Cont）、SRP40発現ベクター、またはp54nrb発現ベクターと共にフィブロネクチンミニ遺伝子構築物（7iBi）をトランスフェクトした. ミニ遺伝子産物（上のパネル）またはGAPDH（下のパネル）に特異的なプライマー（方法を参照）を用いてRT-PCR分析によって細胞から単離した全RNAを決定した。. 図5突然変異体p54nrb（244）によるパラスペックル形成およびCol2a1 mRNAプロセシングの増強. Venus標識野生型または突然変異体p54nrbおよびDsRed-PSP1でトランスフェクトしたATDC5細胞を蛍光顕微鏡下で可視化した. 対照、野生型p54nrb、または突然変異体p54nrbをATDC5細胞にトランスフェクトし、細胞の増殖を細胞増殖アッセイによって決定した. Venus標識野生型または突然変異体p54nrbでトランスフェクトしたATDC5細胞を抗SC-35抗体で免疫染色した. ATDC5細胞をSox9とともに野生型および突然変異体p54nrbでトランスフェクトし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定した. DsRed標識Sox9およびVenus標識p54nrb突然変異体でトランスフェクトしたATDC5細胞を蛍光顕微鏡下でモニターした. Col2a1遺伝子のミニ遺伝子構築物を、ATDC5細胞に示されるような発現プラスミドでトランスフェクトした. ミニ遺伝子産物（上パネル）または - アクチン（下パネル）に特異的なプライマー（方法を参照）を用いたRT-PCR分析により、細胞から単離した全RNAを決定した。. p54nrbが軟骨形成に関与しているかどうかを調べるために、本発明者らは、軟骨細胞分化.

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ATDC5細胞におけるp54nrbの過剰発現は、Col2a1およびAcanの内因性発現を誘導した（図6、A〜D）. 対照的に、p54nrbのノックダウンは、明らかにSox9誘導Col2a1発現を阻害した（図6E）. 次に、本発明者らは、Col2a1 mRNAプロセシングおよびパラスペックル体形成を損なうp54nrb突然変異体の効果を試験した. p54nrb突然変異体の過剰発現は、Sox9誘導Col2a1発現を劇的に阻害した（図6、CおよびD）. また、突然変異体p54nrbは、骨形成タンパク質2誘導性（BMP2誘導性）軟骨細胞分化を無効にした（図6F）. 一方、突然変異体p54nrbは、BMP2誘導骨芽細胞分化に影響を与えなかった（図6G）. さらに、マウス胎児中足骨を用いた器官培養実験は、野生型p54nrbが軟骨形成を刺激する一方、p54nrb変異体はそれを抑制したことを示した（図6、H J）. これらのデータは、p54nrbがそのRRMドメインを介して軟骨細胞分化に重要な役割を果たすことを示している. 示されたようにATDC5細胞をトランスフェクトし、次いでRT-PCR分析に供した. （B）ATDC5細胞におけるCol2a1のp54nrb誘導型IIAおよびIIB型. Col2a1（上のパネル;プライマーセットはCol2a1の2つのアイソフォームを区別することができる）、Col2a1（中央のパネル;プライマーセットは区別することができない）の特異的プライマー（方法を参照）を用いてRT-PCR分析に供したCol2a1の2つのアイソフォーム）、またはα-アクチン. （CおよびD）ATDC5細胞にSox9および/またはMycタグ付き野生型またはMycタグ付き変異体p54nrb（224）アデノウイルスを感染させ、次いでそれぞれノーザン（C）またはウェスタン（D）ブロッティングを行った.

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示されているように、ATDC5細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、次いで、RT-PCR分析によって細胞の全RNAを決定した. C3H10T1 / 2細胞を、BMP2の存在下または非存在下でMyc標識野生型または突然変異体p54nrb（224）アデノウイルスに感染させた. BMP2の存在下または非存在下で、Myc標識野生型または突然変異体p54nrb（224）アデノウイルスに感染したC2C12細胞. マウス胚から単離した中足骨格に、対照、Myc標識野生型p54nrbまたはFlagタグ付き変異体p54nrb（224）アデノウイルスを感染させ、6日間インキュベートし、免疫染色（H）、組織学的分析（I）および試料の統計的分析（J）. インビボでの軟骨形成におけるp54nrbの重要性を実証するために、Col2a1遺伝子プロモーターを用いて、突然変異体p54nrbが軟骨細胞系統に特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製した（図7、A C）. トランスジェニックマウスは、新生児期と出生後3週間の間に小人症を示した（図7、D H）. 組織学的分析は、野生型同腹仔と比較して、トランスジェニックマウスにおいて増殖軟骨細胞の層が著しく薄かったことを示した（図7I）. 変異体p54nrb（図6、CおよびD）の過剰発現によるCol2a1発現の減少と一致して、Col2発現はトランスジェニックマウスにおいて抑制された（図7、JおよびK）. これらの結果は、p54nrbが軟骨細胞分化において重要な役割を果たすことを示している. 軟骨形成におけるp54nrbの役割をさらに理解するために、より若い段階のトランスジェニックマウス. 図8Aに示されるように、誕生時の軟骨の骨化は、トランスジェニックマウスにおいて著しく損なわれた. in situハイブリダイゼーション実験はまた、E15でのトランスジェニックマウスにおける軟骨形成の遅延を示した（図8B）.

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対照的に、図5Bに示す結果と一致して、軟骨細胞の増殖は、トランスジェニックマウスにおいて影響を受けなかった. まとめると、これらのデータは、p54nrbによるCol2a1のmRNAプロセシングの阻害が、トランスジェニックマウスで見られる小人症を生じる骨化の遅延をもたらすことを示唆する. 図7 p54nrb突然変異体を発現するトランスジェニックマウスにおける軟骨形成の増強. （A）トランスジェニックマウスから単離した軟骨細胞におけるトランスジーンの発現. 野生型マウスまたはトランスジェニックマウスから単離した軟骨細胞の全RNAを、導入遺伝子（224）（上のパネル）またはα-アクチン（下のパネル）の特異的プライマー（方法を参照のこと）を用いたRT-. （B）トランスジェニックマウスの軟骨細胞におけるp54nrb変異体の特異的発現. トランスジェニックマウスの脳（レーン1）、腎臓（レーン2）、心臓（レーン3）、肝臓（レーン4）、脾臓（レーン5）、軟骨細胞（レーン6）、または骨芽細胞トランスジーン（224）（上のパネル）または - アクチン（下のパネル）の特異的プライマー（方法を参照）を用いたRT-PCRによって決定した. 野生型マウスまたはトランスジェニックマウスから単離した軟骨細胞の全RNAを、インタクトおよび突然変異p54nrbの両方を認識するTaqmanプローブを用いたリアルタイムPCR分析によって決定した. 野生型マウスまたはトランスジェニックマウスから単離した軟骨細胞の全RNAを、Col2a1のためのTaqmanプローブを用いたリアルタイムPCR分析によって決定した. （A）新生児期の野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの切片を、H＆E、アルシアンブルー、またはフォンコッサ染色した. （B）in situハイブリダイゼーション（Col2a1、Col10a1、PTHR1、Ihh）、H＆E染色およびvon Kossa染色により、E15における野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの切片を決定した. E15における野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの切片を、抗PCNA抗体による免疫染色によって決定した. オリジナル倍率、25（A）;図40（B）。 20（C、WTおよびTgの左パネル）。 40（C、WTおよびTgの右パネル）.